病毒性肺炎后肺血管内皮的再生需要COUP

RegenerationofthepulmonaryvascularendotheliumafterviralpneumoniarequiresCOUP-TF2

急性呼吸窘迫综合征与强烈的炎症反应有关，炎症反应损害血管内皮，损害气体交换。虽然微毛细血管的修复对于避免死亡至关重要，但对如何实现这一点知之甚少。大多数成人组织中的血管修复被认为是通过预先存在的内皮细胞（ECs）重新进入细胞周期来实现的，即血管生成性增殖。这在心脏和主动脉中得到了明确的证明。然而，有报道称，循环中的骨髓来源的细胞被招募到损伤的血管床上，并转分化为新生的内皮细胞，这对这种模式提出了挑战，导致了对内皮修复最相关来源的混淆。试图通过治疗增强肺内皮修复，从而预防或减轻病毒性肺炎的严重程度，需要对内皮重建的起源细胞和分子驱动因素有一个统一的认识。

我们的研究为建立肺血管内皮细胞再生的综合模型奠定了基础。我们直接证明了流感损伤后肺内皮细胞的显著增殖，并且证明血管修复完全来自于先前存在的内皮细胞，没有证据表明其他细胞谱系的血管生成作用。我们认为转录因子COUP-TF2是这个过程的中心调节因子，通过细胞周期调节因子CCND1（cyclinD1）的直接转录激活和通过NRP1（neuropilin1）的激活增强VEGFA/VEGFR2的信号传导，促进EC的增殖和迁移。我们还证明，核因子κB（NF-κB）的促炎细胞因子激活剂在流感感染后早期抑制COUP-TF2，可能抑制早期和更强烈的再生反应。

流感肺损伤时内皮细胞的再生

在探讨病毒损伤后促进内皮细胞再生的机制之前，我们试图更好地描述流感诱导的血管破裂。我们最初用甲型流感病毒株PR8感染VECadCreERT2；lsl-tdTomato小鼠，其引起与人类感染相似的异质性损伤，并允许通过tdTomato表达特异性鉴定内皮细胞，在流感感染后第10天，肺泡周围的毛细血管丛明显受到干扰，表现为CD45+白细胞的深度浸润和血管网络的明显破坏。我们使用流式细胞术定量了流感损伤后内皮细胞的数量，观察到内皮细胞在损伤后第10天和第19天显著减少，然后在第27天趋于恢复，尽管内皮细胞仍未完全恢复到基线水平。然而，这表明肺内皮在损伤后具有再生能力。为了证实这一点，我们在整个损伤过程（27天）中每周三次给药核苷类似物5-乙炔基-2-脱氧尿苷（EdU）（50毫克/千克，腹腔注射），允许对损伤和修复过程中任何时候增殖的细胞进行明确量化。同时，未感染的小鼠[模拟感染磷酸盐缓冲盐水（PBS）在同一时间段内给予相同剂量的EdU，以评估增殖的稳态水平。排除上皮细胞和免疫细胞后，用细胞内EdU流分析法定量增殖内皮细胞。在无损伤的情况下，内皮细胞表现出明显但低水平的EdU掺入（CD45-/EpCAM-/CD31+/EdU+），但通过原位免疫荧光分析，我们明确了基于Ki67与ERG（ETS相关基因）核共定位的增殖内皮细胞，在内皮细胞中表达的一种高度特异的转录因子。值得注意的是，流感损伤12天后观察到分散的内皮细胞增殖，在第19天左右显著增加，而在第27天时观察到极少数增殖的内皮细胞，表明内皮修复过程基本完成。利用肺泡上皮标志物RAGE（晚期糖基化终产物受体）的缺失来区分流感损伤区域，我们发现增殖的内皮细胞主要分布在上皮损伤区域，这与内皮损伤继发于原发性上皮损伤的模型相一致。奇怪的是，在第12天和第19天，我们观察到内皮标志物VECad染色减少的区域，这些区域与上皮病变相邻但不同，并且大部分缺乏增殖的ECs。然而，这种现象在第27天就停止了，这表明一些内皮细胞在流感损伤期间可能经历某种短暂的“适应性转变”。总之，这表明内皮细胞再生发生在流感感染后。

血管内皮细胞增殖的谱系追踪验证

以前在肺和其他组织中的研究表明，循环中的骨髓来源的祖细胞参与内皮修复（即血管生成），但这些研究仍然存在争议。为了确定流感损伤后再生的内皮细胞是否仅来源于先前存在的内皮细胞的增殖，或者是否也可能参与血管生成，VECadCreERT2；lsltdTomato小鼠接受PR8感染，并在30天后当小鼠体重完全恢复时实施安乐死。在这些小鼠中，任何在损伤期间或损伤后获得内皮特性的细胞都不会表达TDT。因此，如果非内皮细胞有助于内皮细胞再生（血管生成），那么在损伤后，谱系标记细胞的比例应减少，而如果先前存在的内皮细胞单独负责修复，则不会发生变化。内皮标志物CD31和血管内皮钙粘蛋白（VECad）的免疫染色显示，基本上所有恢复的内皮细胞仍然具有谱系标记。高定量流式细胞术证实损伤后标记细胞的比例在基线水平和感染后第30天之间没有显著改变。这些结果提示，存活内皮细胞的血管生成性增殖是病毒性肺损伤后内皮修复的主要机制。

流感损伤对COUP-TF2的内皮抑制作用

证明了肺内皮细胞的再生确实发生并且是由内皮细胞本身介导的，我们把注意力转向了这种再生现象的分子驱动因素的鉴定。COUP-TF2是一种孤儿激素受体和转录因子，以前曾参与EC命运选择、血管生成和冠状动脉发育，COUP-TF2在小鼠和人类除动脉外的所有肺EC类型中表达。为了确定COUP-TF2是否参与流感介导的血管损伤的修复，我们通过荧光活化细胞分选（FACS）从感染后第0天（未损伤）、第10天和第27天的小鼠中分离出内皮细胞（CD45-/CD31+）。对COUP-TF2mRNA的定量聚合酶链反应（qPCR）分析显示，流感损伤后肺内皮细胞表达显著下调，与内皮细胞增殖同时缓慢恢复。我们还观察到ECs中三个COUP-TF2靶基因载脂蛋白A1（ApoA1）、Nrp1和细胞色素P家族7亚家族a多肽1（Cyp7a1）的下调和缓慢恢复，与COUP-TF2本身的表达趋势一致。关于内皮修复过程中COUP-TF2的时空表达模式，免疫染色显示，流感感染后第12天和第19天，COUP-TF2的表达降低，并且出现大量缺乏明显COUP-TF2的区域。在第19天，COUP-TF2在具有增殖性ECs（RAGE-上皮病变）的区域中的表达强烈增加。到第27天，内皮修复基本完成，COUP-TF2在整个组织中的表达基本正常化。鉴于COUP-TF2和COUP-TF2靶点的这些动态变化，我们评估了COUP-TF2在肺内皮细胞中的潜在功能修复，第27天，约20%为EdU+，表明至少有15%的ECs是流感损伤后新生成的。

COUP-TF2内皮消融加重流感肺损伤

为了研究COUP-TF2在肺内皮修复中的生理影响，我们将VECadCreERT2小鼠与COUP-TF2flox小鼠杂交以产生杂合子和纯合子突变小鼠，然后通过三苯氧胺给药在成年小鼠中进行COUP-TF2缺失。COUP-TF2缺失2个月后，未受挑战的小鼠未表现出任何明显的表型（。然而，在流感感染后，COUP-TF2EC-/-（VECadCreERT2；COUP-TF2flox/flox）小鼠在感染后第11天变得奄奄一息，表现出过度的体重减轻，毛细血管血氧饱和度显著降低，支气管肺泡灌洗液（BALF）中的总蛋白增加，存活的COUP-TF2EC?/?小鼠在感染后25天内仍然患病，体重或血氧水平没有明显恢复。为了评估COUP-TF2丢失是否影响内皮细胞增殖，我们在感染后9天给小鼠单剂量给予EdU，并在感染后10天给小鼠分离肺内皮细胞。COUP-TF2缺陷的内皮细胞表现出明显的增殖减少（EdU掺入），表明缺乏血管生成增殖能力是病理学增加的主要原因。存活曲线分析表明，约90%的对照小鼠（仅具有VECadCreERT2的小鼠或缺乏CreERT2的COUP-TF2flox/flox小鼠）能够无限期地存活（感染后长达25天），而COUP-TF2（COUP-TF2EC?/?）的消融显著地将存活率降低到50%以下。对存活到第25天的小鼠的COUP-TF2EC?/?肺的组织学分析清楚地显示了更严重的损伤、炎症和重塑，通过肺泡结构破坏、白细胞浸润、肺泡间质增厚和明显纤维化进行评估。此外，共聚焦分析显示，与野生型（WT）组相比，COUP-TF2EC?/?肺表现出更严重的血管间连接中断、异常血管间距增加和血管密度降低。这些结果表明COUP-TF2在体内有效的血管修复和再生中是一个关键的要求。

促炎细胞因子抑制COUP-TF2的体外表达

尽管在肺内皮修复中需要COUP-TF2，但似乎矛盾的是，感染后早期其表达水平降低。促炎细胞因子如白细胞介素-1β（IL-1β）和肿瘤坏死因子-α（TNF-α）在小鼠感染PR8流感后不久都被强烈诱导，值得注意的是，子宫内膜间质细胞中的COUP-TF2表达被这些相同的细胞因子抑制。为了确定这些细胞因子是否与流感感染期间内皮细胞抑制COUP-TF2的作用相似，我们用IL-1β或TNF-α处理永生化人肺微血管内皮细胞（iMVECs）24小时，并证实两种细胞因子在mRNA和蛋白质水平下调iMVECs中的COUP-TF2。TNF-α和IL-1β都是典型NF-κB的有效激活剂，在多种情况下，NF-κB是炎症过程的主要调节因子，在流感病毒感染的小鼠中观察到NF-κB途径的激活。因此，我们假设这些细胞因子通过激活NF-κB抑制COUP-TF2。首先，确定了COUP-TF2/Nr2f2启动子区域中NF-κBp65的结合位点，并通过染色质免疫沉淀（ChIP）–qPCR证实p65富集。接下来，在加入TNF-α或IL-1β24小时之前，用标准的NF-κB途径抑制剂bay11-和JSH-23预处理iMVECs2小时。正如预测的那样，qPCR分析显示COUP-TF2/Nr2f2被两种抑制剂拯救，尽管在IL-1β治疗中BAY11-的程度较低。最后，在从第0天、第10天和第27天分离的小鼠内皮细胞中评估了验证良好的NF-κB靶基因细胞间粘附分子-1（ICAM-1）、血管细胞粘附分子-1（VCAM-1）和E-选择素，所有这些靶基因均表现出与COUP-TF2相反的表达模式，进一步支持NF-κB活性抑制COUP-TF2的结论。这些结果表明，促炎细胞因子IL-1β和TNF-α可通过激活NF-κB抑制ECs中COUP-TF2的表达，因此，适时抑制NF-κB可维持COUP-TF2的水平，促进内皮修复。

COUP-TF2是体外血管生成增殖和迁移所必需的

为了更好地阐明COUP-TF2在体内介导内皮细胞再生的机制，我们再次转向使用iMVECs的体外实验。慢病毒编码Cas9和多个导向rna（gRNAs）（LentiCRISPRv2）直接指向COUP-TF2基因的关键结构域，并用于转导iMVECs，导致COUP-TF2蛋白几乎完全丢失。由于血管生成修复被认为涉及细胞迁移，我们使用划痕试验证明COUP-TF2敲除（KO）（ΔCOUP-TF2）细胞表现出迁移受损。此外，通过EdU掺入和比色增殖测定CCK-8，ΔCOUP-TF2细胞的增殖显著降低。为了控制iMVECs中永生化的任何影响，我们进一步验证了COUP-TF2在原代人肺微血管内皮细胞中的增殖和促进功能。通过转染特定的Nr2f2小干扰RNA（siRNA）（si-Nr2f2），COUP-TF2的表达受到显著抑制，并且在原代内皮细胞中敲除COUP-TF2同样抑制迁移能力，并使用ΔCOUP-TF2iMVECs的细胞增殖潜能RNA测序（RNAseq）来进一步检查结果COUP-TF2在内皮修复过程中的丢失。进行主成分分析（PCA），ΔCOUP-TF2样本形成与WT细胞不同的紧密簇，确认COUP-TF2缺失导致显著的转录变异。接下来，我们分析了这些组之间约个差异表达的基因，以确定COUP-TF2驱动的候选转录模块。Metascape进行了路径和过程富集分析，证明在血管系统发育、细胞迁移调节、细胞增殖和粘附方面显著富集。

我们还通过慢病毒转导过度表达COUP-TF2是否可能进一步增强COUP-TF2介导的迁移和增殖。与对照细胞相比，COUP-TF2-过表达（COUP-TF2-OE）细胞的增殖和迁移率显著增加，这意味着COUP-TF2是内皮再生关键成分的主要驱动因素：细胞增殖和迁移。

COUP-TF2通过直接启动子结合和激活CCND1和NRP1介导血管生成修复

COUP-TF2可以作为转录激活子或阻遏子在不同的细胞环境中通过直接结合目标基因启动子发挥作用，先前的研究表明COUP-TF2可以作为细胞周期调节因子来调节内皮细胞增殖。Ccnd1编码生长调节因子cyclinD1，在发育性血管生成过程中发挥作用，通过RNA序列在ΔCOUP-TF2中下调约3.2倍，代表内皮细胞增殖过程中COUP-TF2的一个关键靶基因。另一个COUP-TF2靶基因Nrp1作为VEGFA亚型的共同受体，对正常血管生成至关重要，并且在流感损伤后肺内皮细胞中显著减少。因此，我们研究了这些基因是否代表COUP-TF2的直接下游靶点。我们使用JASPAR数据库中的COUP-TF2预测基序鉴定了Nrp1和Ccnd1启动子中的COUP-TF2结合位点，并设计了围绕这些序列的引物。芯片qPCR显示COUP-TF2结合Nrp1和Ccnd1的启动子。此外，通过qPCR分析，在COUP-TF2KOiMVECs中Nrp1和Ccnd1均下调。iMVECs的免疫印迹证实COUP-TF2KO细胞中CCND1和NRP1蛋白表达明显缺失。这表明COUP-TF2直接结合并激活Nrp1和Ccnd1的转录。Nrp1可通过VEGFR2增强VEGFA驱动的信号传导。VEGFR2在VEGFA结合后与NRP1形成复合物，导致VEGFR2磷酸化并激活参与细胞迁移和血管新生芽形成的信号通路。为了研究COUP-TF2的缺失是否减弱了VEGFA/VEGFR2信号介导的血管生成作用，我们评估了COUP-TF2对VEGFA诱导的细胞增殖和迁移的依赖性。iMVECs在有或没有VEGFA的情况下培养24、48和72小时，并评估其增殖情况。COUP-TF2缺失轻微但显著减弱VEGFA对iMVECs的有丝分裂作用。此外，VEGFA更明显地诱导了iMVECs的迁移，其被COUP-TF2缺失所消除。COUP-TF2的过表达增强了增殖和迁移，但无法通过VEGFA治疗进一步增强，可能是由于CCND1的直接上调或细胞周期激活压倒了NRP1/VEGFR2信号的任何额外的有丝分裂作用。使用选择性NRP1抑制剂ATWLPPR肽TFA（三氟乙酸）阻断VEGFA与NRP1的结合，抑制了迁移，尽管这种效应没有达到统计学意义，并且NRP1抑制对VEGFA诱导的增殖没有显著影响。这些结果表明COUP-TF2介导的增殖在很大程度上依赖于CCND1，而NRP1可能对细胞迁移有更大的影响。然后我们询问VEGFR2依赖性信号是否受到COUP-TF2的影响。用VEGFA处理iMVECs30分钟后，收集细胞，通过Westernblotting检测VEGFR2的磷酸化。COUP-TF2的缺失降低了Tyr处VEGFR2的磷酸化，而COUP-TF2的过度表达略微增强了VEGFR2的磷酸化。总之，COUP-TF2促进NRP1的转录，其作用是放大VEGFA诱导的血管生成：在与VEGFA结合后，NRP1与VEGFR2形成复合物，导致VEGFR2在Tyr处磷酸化，从而激活下游血管生成信号通路并促进内皮细胞迁移和增殖。COUP-TF2的缺失导致NRP1表达减少，从而抑制NRP1/VEGFR2介导的血管生成。

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